色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

为啥要学习使用高效液相色谱柱 ？

色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路，建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。

　　高效液相色谱柱的适用范围：

　　本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。

　　责任人：

　　液相色谱柱使用者。

　　液相色谱柱的安装

1.液相色谱柱的结构：

　　（1）液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。

　　柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。

　　密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。

　　（2）柱填料：

　　液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

　　正相柱：

　　多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

　　反相柱：

　　主要是以硅胶为基，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

　　常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10μm之间。

2.色谱柱的安装：

　　（1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

　　（2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

　　（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如，条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0.1～0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。

　液相色谱柱的使用

　　色谱柱在使用前，好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

　　1.样品的前处理：

　　（1）好使用流动相溶解样品；

　　（2）使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂；

　　（3）使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂；

　　2.流动相的配制：

　　液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离的目的，因此，要求流动相具备以下的特点：

　　（1）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

　　（2）流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

　　（3）流动相的黏度要尽小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时，降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

　　（4）流动相的物化性要与使用的检测器相适应，如使用UV检测器，好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

　　（5）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

　　（6）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微氧与样品发生作用。

　　3.流速的选择：

　　因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求佳柱效，好使用佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mL/min为佳。当选用佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如，使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含)。

　　4.流动相使用注意事项：

　　（1）由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

　　（2）对于正相柱推荐使用沸程为30-60 ℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂，有可能影响分析结果。

　　（3）含水流动相好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。好加入，防止细菌生长。

　　（4）流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂。

　　（5）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

　　液相色谱柱的保存

　　1.反向色谱柱实验后的保养：

　　使用缓冲液或含盐的流动相，实验完后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

　　2.保存色谱柱：

　　如，色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下，对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂或硫柳汞)中，并将堵头堵上，储存温度好是室温。

　　液相色谱柱的再生

　　因为，色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说是柱效的下降。

　　1.反向柱的再生：

　　依次采用20～30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90(V/V)，乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

　　2.正相柱的再生：

　　依次以20～30倍的色谱柱体积正己烷、异丙醇(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高)、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意以上溶剂必须严格脱水。

　　3.离子交换柱的再生：

　　长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降。用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。

　　特别说明：

　　再生过程必须关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。再生时好选择不具备在线脱气的独立泵送系统色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪器精密部件。

　　液相色谱柱常见问题分析与解决方案

　　1.使用一段时间后柱压过高：

　　解决方案：首先查看是否HPLC系统原因，排除系统原因后，原因基本是由于实验过程中杂在柱中的累积。尽完善操作条件，做完样品后要及时冲洗干净，如缓冲盐的流动相一定要用高比例的水溶液(如，90％)冲洗完全后再用有机相保存。

　　2.筛板堵塞与柱头塌陷：

　　解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20分钟左右，再用纯水超声20分钟左右，重新装入色谱柱。

　　3.色谱柱头的填料被样品污染：

　　解决方法：

　　如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

　　4.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出：

　　解决方法：

　　如确定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

　　注意事项：

　　1.无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间(30min以上)走空，否则易使色谱柱干涸且带入大几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。

　　2.使用与保存时，严禁用力甩，杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。

　　3.当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；

　　4.避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

　　5.进样样品要全溶解；

　　6.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽不超过该色谱柱的pH范围；

　　7.每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；

　　8.每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；

　　9.若分析柱不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。